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超凈工作臺在生物學實驗中的應用
點擊數：5962022-03-08 13:54:29 來源: 青島凈化、山東凈化公司、山東空氣凈化工程
新聞摘要:主要儀器和試劑：DMEM培養基、胰蛋白酶、I型膠原酶、，二甲基亞砜、MTT、small牛血清、fetal牛血清、annexinv凋亡檢測試劑盒、mondel680酶標儀、垂直流式超凈工作臺、CO2細胞培養箱、倒置顯微鏡和流式細胞術
近年來，隨著組織工程和再生醫學的迅速發展，脂肪干細胞因其來源豐富、免疫功能低下、具有多向分化潛能等優點成為研究熱點。然而，以往的研究大多集中在ADSCs多向分化潛能在組織工程和再生醫學中的應用，而對ADSCs分泌功能在組織損傷修復中的作用關注甚少。本實驗利用super clean workbench觀察和研究了ADSCs分泌功能對成纖維細胞的生物學效應，探討了ADSCs分泌功能促進傷口愈合的機制
1主要儀器和試劑：DMEM培養基、胰蛋白酶、I型膠原酶、，二甲基亞砜、MTT、small牛血清、fetal牛血清、annexinv凋亡檢測試劑盒、mondel680酶標儀、垂直流式超凈工作臺、CO2細胞培養箱、倒置顯微鏡和流式細胞術
2脂肪干細胞分離和培養：從腹部手術患者中提取約59個皮下脂肪組織，無菌條件下用剪刀去除血管等組織碎片，用含雙抗體的PBS溶液反復浸泡沖洗3次，每次約5min，用眼剪將脂肪組織剪成約1mm3的碎片，放入0.1%Ⅰ型膠原酶中，在37℃水浴中振蕩消化1H；加入等體積的l0%胎兒牛血清精消化液后，用200目細胞篩過濾，600g離心10min，丟棄上層脂肪和上清液，用l0%胎兒牛血清培養基復懸沉淀，接種于培養瓶中，置于37℃和5%的CO2培養箱中常規培養。2天后，更換溶液，將細胞傳代至80%
制備ADSCs培養上清液：選擇生長良好的第三代ADSCs細胞，接種于75cm2的培養瓶中。當生長**80%融合后，用15ml血清培養基DMEM代替。培養3天后，收集上清液。通過o.22μM濾膜過濾純化上清液。分裝，一個80。C.冷凍備用
培養4例人皮膚成纖維細胞：原代細胞采用組織塊法培養，置于10%small牛血清培養基中，在37℃和5%C02培養箱中培養
5成纖維細胞增殖測定：MTT法。取第三代成纖維細胞3×10孔接種于12孔板上，常規培養24小時后丟棄上清液，設實驗組和對照組。實驗組用adsc-cm和2%的small牛血清中劑量配制，對照組只用2%的small牛血清中劑量配制，每組3口井。每組加入相應培養基的LML。連續培養3天后，每個孔中分別加入5gL mtt100μL。在37℃和5%C02下培養4小時后，精培養：吸取并丟棄上清液，向每個孔中加入750μL元寶楓，連續培養1分鐘后，輕輕搖動以溶解紫藍色沉淀，然后μL孔移動**96孔板，每個孔重復5次。通過微孔板讀數器測量490nm波長處的吸光度值。
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